TY - BOOK
T1 - Stem cell mediated liver regeneration:
T2 - Cross-species differences, Marker expression, Impact of the thymus dependent immune response.
AU - Jelnes, Peter
PY - 2008
Y1 - 2008
N2 - Leversygdomme er et udbredt sundhedsproblem verden over. Kroniske leversygdomme er karakteriseret ved en kontinuerlig ødelæggelse af leverparenkymet samt fibrose. Den nuværende og foretrukne behandling af terminale leversygdomme er levertransplantation med efterfølgende immunsuppressiv behandling. Manglende donorer samt en øget efterspørgsel på samme har iværksat søgen efter alternative behandlingsmuligheder. Leveren har en beundringsværdig evne til at regenerere efter påtvungne skader. Denne evne er illustreret ved et dualistisk regenerativt respons, som kan aktiveres og mediere gendannelse af tabt levermasse samt -funktion. Proliferation af differentierede celler, dvs. hepatocytter og galdegangsceller, er den primære regenerative celleunit i den skadede voksne lever. Ved kontinuerligt tab og ødelæggelse af levermasse i kroniske leversygdomme ses et sekundært stamcelle medieret regenerativt respons. Adskillige protokoller for stamcelle medieret leverregenerering i forsøgsdyr er blevet etableret, og fællesnævneren for disse er at behandlingen kombinerer delvis eller fuldstændig blokering af replikationen af hepatocytter med et mitogent og skade stimulus. Undersøgelser fra vores laboratorium har tidligere påvist at flere medlemmer tilhørende Interferon-¿ netværket var udtrykt af hepatiske progenitor celler (HPCr) i rotten. Disse observationer dannede grundlag for det originale formål for denne Ph.D. afhandling, nemlig at undersøge hvilke indflydelse immunrespons relaterede faktorer havde på stamcelle medieret leverregenerering. Det traditionelle valg af forsøgsdyr indenfor leverregenerationsområdet er rotten, men grundet musens genetiske fordele, i forhold til genknockout og transgenesis, er antallet af undersøgelser der benytter sig af mus stærkt stigende. Vores eksperimentelle design inkluderede netop brugen af specifikke genknockout mus, men idet brugen af mus først skulle implementeres testede vi flere rapporterede museprotokoller for stamcelle medieret leverregeneration for at udvælge den bedst egnede. En hidtil ukendt fænotypisk forskel, sammenlignet med den velkendte fænotype i rotter, blev observeret. Denne observation dannede grundlag for at iværksætte et større studie, hvor mus og rotter blev underkastet flere rapporterede stamcelle initierende protokoller med efterfølgende analyse af HPC responset. Mus og rotter blev underkastet behandling med 2-acetylaminofluren (2-AAF) kombineret med en 70% partiel hepatectomi, en diet uden kolin men tilsat ethionin i drikkevandet (CDE) samt en diet indeholdende 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidin (DDC). HPCr i rotter udtrykte galdegangs specifik cytokeratin og de specifikke markører, a-fetoprotein (AFP) og delta-like kinase (Dlk1). HPCr i mus udtrykte ligeledes galdegangs specifik cytokeratin, men de udtrykte overraskende nok ikke AFP og Dlk1. AFP ekspression blev observeret i hepatocytter og kun en ganske sjælden population af celler udtrykte Dlk1. Yderligere blev ABCG2 fundet specifikt udtrykt af HPCr i rotten, hvorimod mus udtrykte ABCG2 i hepatocytter, HPCr og galdegangsepitelceller. Den eneste protokol som var i stand til at inducere et HPC respons i begge arter var CDE protokollen. 2-AAF/PHx protokollen i mus resulterede ikke i akkumulerende HPCr som tidligere rapporteret, hvorimod DDC protokollen resulterede i markant akkumulering af HPCr i mus men blev fundet ineffektiv i rotter. Disse resultater påviste en hidtil ukendt og markant forskel i den præsenterede HPC fænotype i rotter og mus og understregede betydningen af forsigtig ekstrapolering af observationer arter imellem. Identificering af specifikke overflademarkører for leverstam- og progenitorceller er af stor betydning, idet det vil tillade sortering, manipulering og efterfølgende transplantation af specifikke stamcellederiverede cellepopulationer. Som led i karakteriseringen og belysningen af immunrespons relaterede faktorers effekt på HPCr havde vi udformet en strategi som involverede isolering af HPCr vha. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS). Isolerede celler skulle efterfølgende undersøges ved in vitro studier som implicerede tilsætning af specifikke immunrespons relaterede faktorer. Kun få specifikke overflade HPC markører er blevet identificeret. Thy1 er et eksempel herpå og er sandsynligvis den overflade markør, som er benyttet flest gange til at isolere HPCr. Før iværksættelse af isoleringsforsøg undersøgte vi Thy1 ekspressionen i rotter underkastet 2-AAF/PHx protokollen. Analysen viste at Thy1 ekspressionen fulgte udviklingen af HPC responset. Men efterfølgende immunhistokemi kunne ikke underbygge at Thy1 var en markør for HPCs, hvilket dannede grundlag for en deltaljeret undersøgelse af ekspression og den cellulære lokalisering af Thy1 i regenererende levere. Analyse af beriget HPCr samt lasercaptured HPC strukturer udviste AFP men ikke Thy1 ekspression. Immunhistokemi lokaliserede Thy1 til celler der qua deres lokalisering udenfor den HPC omkransende basal membran kunne være hepatiske Stellateceller/myofibroblaster. Dobbeltfarvninger med kombinationer af hepatiske Stellatecelle/myofibroblast og HPC markører underbyggede denne observation og co-lokaliserede Thy1 til smoth muscle actin positive hepatiske Stellatecelle populationer og ikke HPCr. Undersøgelsen påviste lignende lokalisering af Thy1 i rotte fibrose modeller samt i patienter med fulminant leversvigt. Konklusionen på dette studie var, at Thy1 ikke blev udtrykt af HPCr, som tidligere publiceret, men af hepatiske Stellateceller/myofibroblaster. Endvidere lagde denne observation op til at tidligere studier baseret på Thy1 isolering bør revurderes og fortolkes med forsigtighed. Idet mus ikke fandtes at være velkarakteriseret nok til at undersøge funktionen af immunresponset under stamcelle medieret leverregenerering udformede vi et alternativt eksperimentelt design som inkluderede brugen af nøgne rotter (rnu-/-). Rnu-/- rotter mangler thymus og har derfor svært nedsat densitet af funktionelle T-celler, hvilket tillod at undersøge effekten af det thymus afhængige immunrespons på stamcelle medieret leverregenerering. HPC responset i 2-AAF/PHx behandlede rnu-/-, deres heterozygote, men med funktionel thymus, stammefæller (rnu+/-) samt F344 rotter blev analyseret ved HE-farvning, immunhistokemi, samt specifik genekspressionsanalyse. HE-farvning og immunolokalisering af OV6 og Dlk1 påviste et sammenligneligt respons i begge stammer 1 og 5 dage efter PHx. Et markant anderledes HPC respons blev observeret 9 dage efter PHx. HE-farvning påviste udvikling af store basofile hepatocytiske foci i peri-portalområdet i rnu-/- rotter og kvantificering af HPC responset viste at denne udvikling blev ledsaget af et signifikant nedsat HPC respons sammenlignet med rnu+/- rotter. Yderligere immunhistokemiske undersøgelser indikerede at nydannede hepatocytter var deriveret fra HPCr, samt at antallet af delende non-parenkymalceller og nydannede hepatocytter hhv. var signifikant nedsat og forøget i rnu-/- rotter sammenlignet med rnu+/-. Observationerne påviste at det thymus afhængige immunrespons har en central rolle i reguleringen af proliferation og differentiering af HPCr, og indikerer at dette immunrespons via primær hæmning af den hepatocytiske differentiering sekundært bibeholder HPCr i et mere primitivt og ekspanderende stadie.
AB - Leversygdomme er et udbredt sundhedsproblem verden over. Kroniske leversygdomme er karakteriseret ved en kontinuerlig ødelæggelse af leverparenkymet samt fibrose. Den nuværende og foretrukne behandling af terminale leversygdomme er levertransplantation med efterfølgende immunsuppressiv behandling. Manglende donorer samt en øget efterspørgsel på samme har iværksat søgen efter alternative behandlingsmuligheder. Leveren har en beundringsværdig evne til at regenerere efter påtvungne skader. Denne evne er illustreret ved et dualistisk regenerativt respons, som kan aktiveres og mediere gendannelse af tabt levermasse samt -funktion. Proliferation af differentierede celler, dvs. hepatocytter og galdegangsceller, er den primære regenerative celleunit i den skadede voksne lever. Ved kontinuerligt tab og ødelæggelse af levermasse i kroniske leversygdomme ses et sekundært stamcelle medieret regenerativt respons. Adskillige protokoller for stamcelle medieret leverregenerering i forsøgsdyr er blevet etableret, og fællesnævneren for disse er at behandlingen kombinerer delvis eller fuldstændig blokering af replikationen af hepatocytter med et mitogent og skade stimulus. Undersøgelser fra vores laboratorium har tidligere påvist at flere medlemmer tilhørende Interferon-¿ netværket var udtrykt af hepatiske progenitor celler (HPCr) i rotten. Disse observationer dannede grundlag for det originale formål for denne Ph.D. afhandling, nemlig at undersøge hvilke indflydelse immunrespons relaterede faktorer havde på stamcelle medieret leverregenerering. Det traditionelle valg af forsøgsdyr indenfor leverregenerationsområdet er rotten, men grundet musens genetiske fordele, i forhold til genknockout og transgenesis, er antallet af undersøgelser der benytter sig af mus stærkt stigende. Vores eksperimentelle design inkluderede netop brugen af specifikke genknockout mus, men idet brugen af mus først skulle implementeres testede vi flere rapporterede museprotokoller for stamcelle medieret leverregeneration for at udvælge den bedst egnede. En hidtil ukendt fænotypisk forskel, sammenlignet med den velkendte fænotype i rotter, blev observeret. Denne observation dannede grundlag for at iværksætte et større studie, hvor mus og rotter blev underkastet flere rapporterede stamcelle initierende protokoller med efterfølgende analyse af HPC responset. Mus og rotter blev underkastet behandling med 2-acetylaminofluren (2-AAF) kombineret med en 70% partiel hepatectomi, en diet uden kolin men tilsat ethionin i drikkevandet (CDE) samt en diet indeholdende 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidin (DDC). HPCr i rotter udtrykte galdegangs specifik cytokeratin og de specifikke markører, a-fetoprotein (AFP) og delta-like kinase (Dlk1). HPCr i mus udtrykte ligeledes galdegangs specifik cytokeratin, men de udtrykte overraskende nok ikke AFP og Dlk1. AFP ekspression blev observeret i hepatocytter og kun en ganske sjælden population af celler udtrykte Dlk1. Yderligere blev ABCG2 fundet specifikt udtrykt af HPCr i rotten, hvorimod mus udtrykte ABCG2 i hepatocytter, HPCr og galdegangsepitelceller. Den eneste protokol som var i stand til at inducere et HPC respons i begge arter var CDE protokollen. 2-AAF/PHx protokollen i mus resulterede ikke i akkumulerende HPCr som tidligere rapporteret, hvorimod DDC protokollen resulterede i markant akkumulering af HPCr i mus men blev fundet ineffektiv i rotter. Disse resultater påviste en hidtil ukendt og markant forskel i den præsenterede HPC fænotype i rotter og mus og understregede betydningen af forsigtig ekstrapolering af observationer arter imellem. Identificering af specifikke overflademarkører for leverstam- og progenitorceller er af stor betydning, idet det vil tillade sortering, manipulering og efterfølgende transplantation af specifikke stamcellederiverede cellepopulationer. Som led i karakteriseringen og belysningen af immunrespons relaterede faktorers effekt på HPCr havde vi udformet en strategi som involverede isolering af HPCr vha. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS). Isolerede celler skulle efterfølgende undersøges ved in vitro studier som implicerede tilsætning af specifikke immunrespons relaterede faktorer. Kun få specifikke overflade HPC markører er blevet identificeret. Thy1 er et eksempel herpå og er sandsynligvis den overflade markør, som er benyttet flest gange til at isolere HPCr. Før iværksættelse af isoleringsforsøg undersøgte vi Thy1 ekspressionen i rotter underkastet 2-AAF/PHx protokollen. Analysen viste at Thy1 ekspressionen fulgte udviklingen af HPC responset. Men efterfølgende immunhistokemi kunne ikke underbygge at Thy1 var en markør for HPCs, hvilket dannede grundlag for en deltaljeret undersøgelse af ekspression og den cellulære lokalisering af Thy1 i regenererende levere. Analyse af beriget HPCr samt lasercaptured HPC strukturer udviste AFP men ikke Thy1 ekspression. Immunhistokemi lokaliserede Thy1 til celler der qua deres lokalisering udenfor den HPC omkransende basal membran kunne være hepatiske Stellateceller/myofibroblaster. Dobbeltfarvninger med kombinationer af hepatiske Stellatecelle/myofibroblast og HPC markører underbyggede denne observation og co-lokaliserede Thy1 til smoth muscle actin positive hepatiske Stellatecelle populationer og ikke HPCr. Undersøgelsen påviste lignende lokalisering af Thy1 i rotte fibrose modeller samt i patienter med fulminant leversvigt. Konklusionen på dette studie var, at Thy1 ikke blev udtrykt af HPCr, som tidligere publiceret, men af hepatiske Stellateceller/myofibroblaster. Endvidere lagde denne observation op til at tidligere studier baseret på Thy1 isolering bør revurderes og fortolkes med forsigtighed. Idet mus ikke fandtes at være velkarakteriseret nok til at undersøge funktionen af immunresponset under stamcelle medieret leverregenerering udformede vi et alternativt eksperimentelt design som inkluderede brugen af nøgne rotter (rnu-/-). Rnu-/- rotter mangler thymus og har derfor svært nedsat densitet af funktionelle T-celler, hvilket tillod at undersøge effekten af det thymus afhængige immunrespons på stamcelle medieret leverregenerering. HPC responset i 2-AAF/PHx behandlede rnu-/-, deres heterozygote, men med funktionel thymus, stammefæller (rnu+/-) samt F344 rotter blev analyseret ved HE-farvning, immunhistokemi, samt specifik genekspressionsanalyse. HE-farvning og immunolokalisering af OV6 og Dlk1 påviste et sammenligneligt respons i begge stammer 1 og 5 dage efter PHx. Et markant anderledes HPC respons blev observeret 9 dage efter PHx. HE-farvning påviste udvikling af store basofile hepatocytiske foci i peri-portalområdet i rnu-/- rotter og kvantificering af HPC responset viste at denne udvikling blev ledsaget af et signifikant nedsat HPC respons sammenlignet med rnu+/- rotter. Yderligere immunhistokemiske undersøgelser indikerede at nydannede hepatocytter var deriveret fra HPCr, samt at antallet af delende non-parenkymalceller og nydannede hepatocytter hhv. var signifikant nedsat og forøget i rnu-/- rotter sammenlignet med rnu+/-. Observationerne påviste at det thymus afhængige immunrespons har en central rolle i reguleringen af proliferation og differentiering af HPCr, og indikerer at dette immunrespons via primær hæmning af den hepatocytiske differentiering sekundært bibeholder HPCr i et mere primitivt og ekspanderende stadie.
M3 - Ph.D. thesis
BT - Stem cell mediated liver regeneration:
PB - Museum Tusculanum
ER -